杨丽华：华西医院进修成果分享

近几年，医院坚持科技兴院、人才强院战略，特别重视青年医生的培养和发展，为医院的发展注入了活力和源泉。按照全面提高和重点培养相结合，培养和适用相结合的办法，每年都有大批青年骨干到华西、省人民医院、成都中医大附属医院和广元三甲医院进修学习，进修回院后院内交流学习成果，科内新业务、新技术陆续开展，团队业务水平得到了明显提高。

杨丽华同志就是我院优秀青年后备人才队伍中的一员，本文是她在华西进修期间的学习心得，已经华西医院教授审核并在华西微网和官网发出，供全院交流学习，这对杨丽华同志是一个极大的肯定和鼓励。

希望中医院广大青年不断创新工作方法，不断攻克工作难题，不断提高自己的专业素养，完善本职工作，以更加饱满的热情投入到工作中，更好地为人民服务。     

金黄色葡萄球菌小菌落变异型引起的感染

现病史

患者，男，41岁，因右下肢骨折术后12年,右小腿伤口反复间断肿痛、流脓2年。

既往史

患者于12年前因车祸伤致右下肢开放粉碎骨折合并血管、神经损伤，住我院骨科行右下肢伤口清创、损伤血管吻合、骨折复位钢板内固定术，伤后患者残留右足下垂内翻畸形以及右小腿前内及外侧麻木至今，患者术后3个月扶双拐下地负重行走，于术后7个月完全弃拐行走。

2⁺年前，患者右小腿上段无明显诱因出现红肿疼痛，不久出现皮肤破溃，有约2cm小伤口，就诊我院骨科门诊，予伤口换药、口服阿莫西林胶囊约20天，伤口红肿消退自行愈合。

之后间隔1年再次出现上部位伤口红肿、疼痛、皮肤未破溃按上处理，半个月再次红肿疼痛消退。

于去年10月份，该部位又出现红肿、疼痛以及破溃流脓，再次我院门诊换药、口服头孢克洛治疗，伤口未见最终愈合，为进一步治疗经门诊检查后，以“右股骨干、右胫腓骨骨折内固定术后（骨性愈合）；右小腿感染；右下肢腓总神经损伤；右踝关节僵直”收住。患者右小腿出现红肿、疼痛、破溃流脓期间均无发热，精神、饮食良好，大小便正常。

既往史：无

输血史：有

个人史：无不良嗜好

查体

T：36.3℃，P：85次/分，R：19次/分，BP：117/80mmHg。神志清楚，无病容，皮肤巩膜无黄染，全身浅表淋巴结未见肿大。颈静脉正常。心界正常，心律齐，各瓣膜区未闻及杂音。胸廓未见异常，双肺叩诊呈清音，双肺呼吸音清，未闻及干湿啰音及胸膜摩擦音。腹部外形正常，全腹柔软，无压痛及反跳痛，腹部未触及包块，肝脏肋下未触及，脾脏肋下未触及，双肾未触及。双上肢、左下肢无畸形，感觉、活动良好。

专科情况

视：右足下垂内翻畸形，右大腿中下段、右小腿前外侧可见皮肤伤口愈合疤痕，右小腿上段内侧可见约3cm伤口，钢板部分外露，伤口周围皮肤红肿，伤口有少量渗出。

触：右小腿伤口局部触痛（+），右大腿及右小腿除伤口局部外无压痛。右膝下胫前、外侧以及足背皮肤针刺觉麻木，右大腿、右小腿后侧、右足底皮肤针刺觉正常。右足背动脉可触及。

影像学检查

右胫腓骨正侧位X线片：右胫骨上段可见内固定钢板螺钉在位，未见断裂，右胫骨近端可见三角形低密度灶，周围可见硬化，右胫骨中上段骨质密度增高，原骨折线已消失。

实验室一般检查

CRP：10.80mg/L↑(＜5)； 血沉：46.0mm/h↑(＜21),其余未见异常。

微生物检查（4.22）

送检伤口分泌物涂片革兰染色、细菌培养结果均阴性。

初步诊断

右小腿感染慢性骨髓炎钢板外露；右腓总神经损伤（马蹄足畸形）；右股骨干、右胫腓骨骨折内固定术后(骨性愈合）；右踝关节僵直；右膝关节屈曲活动受限。

诊疗计划

1、向患者及家属交待病情及注意事项。

2、向上级医生汇报患者病情。

3、完善入院相关检查。

4、给予伤口换药，行伤口分泌物培养+药敏试验。

5、专业组讨论。

6、择期手术。

治疗情况

艾利克冲洗伤口，口服利福平，克林霉素1200 mg/qd常规抗感染治疗。

4.28行右小腿伤口扩创、病灶清除、内固定物取出+筋膜瓣成形术。术中对钉孔部刮除物送细菌涂片及培养，术后继续口服利福平，克林霉素1200 mg/qd抗感染、预防血栓治疗。

4.30安排出院，继续口服利福平治疗，定期门诊复查。

后续检查结果回馈（5.6）

4.28 送术中钉孔部刮除物细菌涂片及培养。细菌涂片革兰染色：极少G+球菌，少量G-杆菌；培养结果：5.6报告金黄色葡萄球菌及手工K-B法药敏结果。

4.30菌落细小、针尖样，无溶血。质谱鉴定为：金黄色葡萄球菌（2.424）。染色：G+C，因菌落不典型、针尖样大小，继续孵育。

    图一

　图二　

　　图一：原始平板，CO₂环境35℃孵育6天；图二：菌落革兰染色

5.1第二次质谱结果为：金黄色葡萄球菌，分值2.320，血浆凝固酶：阳性，染色：G+C，原始平板分纯；

5.4按一般阳性球菌上梅里埃VITEK2-Compact GP卡鉴定及GP67药敏卡；

5.5 无鉴定结果，药敏只有苯唑西林≦0.25，S；替加环素≦0.12，S，其他药无结果，K-B法做药敏；

5.6 第三次质谱结果仍为：金黄色葡萄球菌，质谱分值2.230，报告鉴定及药敏结果。

第三代培养24h后，出现β溶血现象，再次上机（梅里埃VITEK 2-compact GP卡及GP67药敏卡），鉴定为松鼠葡萄球菌，鉴定可信度98%。

图一：二氧化碳环境孵育24h，图二：二氧化碳环境孵育48h，

图三：二氧化碳环境孵育24h，图四：二氧化碳环境孵育48h。

    　图一   

图二

图三

图四

质谱和鉴定仪结果不一致。送成都擎科做基因测序，结果为：金黄色葡萄球菌。

药敏结果

SASCVs形成机制

目前研究认为，SASCVs临床分离株多数是由于呼吸作用时合成能量不足所致，主要表现为与呼吸链相关的两种特异营养缺陷类型，即电子传递链缺陷型和胸腺嘧啶脱氧核苷合成缺陷型。前者又分为甲萘醌营养缺陷型和血红素营养缺陷型，主要表现为甲萘醌或血红素缺陷。该类SASCVs的产生与氨基糖苷类抗菌药物的使用密切相关。不论体内外，在氨基糖苷类药物存在的情况下，金葡菌形成SCV的概率均显著提高。胸腺嘧啶脱氧核苷（TD）合成缺陷型SASCVs（TD-SASCVs）是金葡菌对外源胸腺嘧啶脱氧核苷吸收受阻所致，主要见于长期应用甲氧苄啶-磺胺甲唑（SXT）等磺胺类药物的病例，该类药能够阻止

四氢叶酸的合成，而后者是胸腺嘧啶核苷酸合成酶的一个辅基。此外，还存在其他类型如CO 2 营养缺陷型和营养缺陷不明的SASCVs分离株。而SASCVs临床分离株有时可表现为多种营养缺陷共存。因SASCVs与其亲本株可同时出现，而SASCVs可以快速回复成野生株表型，且这种转化在体内外均可进行，故近年来人们又提出SCVs的发生与金葡菌发生基因突变有关。目前，已经报道多种基因（ctaA、menB、menD、hemA、hemB、hemH、mutS、fusA、thyA）的突变均能导致金葡菌出现SASCV表型   。

SASCVs的致病因素

金葡菌SCVs是可引起长期持久的反复发作的感染。金葡菌SCVs是细胞内持久性存在的适应表型。生存方式的改变和细菌代谢的深刻变化,影响病原菌与宿主间的相互作用，导致以SCVs感染为特征的慢性难治性感染。胞内生存方式还可保护细菌免受抗菌药物和宿主防御系统的攻击。金葡菌SCVs感染不仅存在于人类，在畜牧兽医学和食品微生物学领域也有报道。

SASCVs相关临床感染性疾病

早期研究发现，一些非特异性吞噬细胞如内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、造骨细胞、角质化细胞可有效吞噬金葡菌。被吞噬的为正常金葡菌时，内吞作用可迅速破坏裂解细菌胞体。近年研究发现，SASCVs比相应的野生株更能持续存活于细胞中，同时细胞对SCVs的内吞作用可使SCVs免受宿主防御系统和抗菌药物的攻击。而当宿主细胞形成应激的保护性环境时，SCVs就会引起隐性或复发性感染。迄今为止SASCVs对慢性感染疾病的重要意义已达成共识，临床上已报道与SASCVs有关的感染多种多样，主要见于以下几大类疾病：慢性骨感染，皮肤、粘膜和软组织感染，脓肿，髋假体关节感染，囊性纤维化呼吸道感染，心脏相关植入的感染。

培养和鉴定

仔细处理标本和选择合适的琼脂平皿进行培养是SCVs诊断的先决条件。葡萄球菌SCVs在哥伦比亚血平皿上空气和二氧化碳环境中均能生长，使用葡萄球菌选择性培养基或显色培养基反而不生长或生长不良，故首选哥伦比亚血平皿。SCVs通常在24 h以后，大约48～72 h才能在固体培养基上肉眼可见。其菌落细小，约为亲代正常菌株的1/10，多呈针尖样（TD-SCVs可表现出一种不同寻常的“荷包蛋”样菌落），无色素或色素生成明显减少，缺失或β-溶血能力下降，容易被误认为是生长缓慢的棒状杆菌或非溶血性的链球菌。此外，它们经常与亲代菌株混合生长，表型并不稳定，极易恢复正常表型。由于SCVs生长缓慢，代谢变化大，经典生化反应缺失或减少，过氧化氢酶、凝固因子、凝血酶反应或其他用于识别的反应也被延迟或缺如，因此，所有基于生化过程的鉴定方法在SCVs中都不可靠，目前主要依靠PCR和基因测序技术。已被证实为金葡菌识别的分子指标如nuc、clfA、eap、coa、sodM等也能很好地识别SASCVs。对于正常的葡萄球菌表型，16SrRNA特别是rpoB基因序列，对于最终确定种和亚种非常有用。然而，鉴定葡萄球菌SCVs，必须考虑已知公共序列数据库的局限性。

药敏试验

由于SCVs的低生长率和低代谢率，各种常规方法检测其对抗生素的敏感性存在困难或不能完成。因此，尽管传统的方法（琼脂扩散法或E 试验）可以提供SCVs对抗生素敏感与否的证据，但应保证细菌必须在琼脂平皿上生长足够的时间（3～5 d），更要谨慎地评估其MIC数据。因SCVs是在细胞内环境中被诱导和选择的，故一些体外细胞培养模型被用来进一步研究SCVs在细胞内的抗药性 。综合起来，这些模型结果显示，所有抗菌药物在细胞内对正常菌株的活性都比对SCVs菌株高，提示在宿主细胞内，SCVs对药物治疗具有更高的耐受性，临床在治疗SCVs感染时要充分考虑到这些因素。

SASCVs感染的治疗

目前对葡萄球菌SCVs感染的最佳治疗方法尚不清楚，但临床在选择治疗方案时应综合考虑以下问题：①SCVs营养缺陷的类型；②SCVs在宿主细胞内的位置；③SCVs和∕或亲代菌株药敏试验的结果。此外，还必须考虑各感染部位的药动学 /药效学（PK/PD）数据等 。而理想的抗SCVs药物，不但要具有能够穿透细胞膜进入SCVs所在宿主细胞内的能力，还能在胞内保持杀灭这种缓慢生长表型细菌的抗菌活性。利福平是能够满足这些要求的抗葡萄球菌药物，但利福平单药使用将很快出现高水平耐药，故建议联合其他一种或多种敏感的抗生素共同治疗SCVs。将达托霉素、利福平及庆大霉素三者合用或达托霉素-利福平或庆大霉素-利福平二者配伍使用对清除人单核细胞源性巨噬细胞内的SASCVs效果最为明显。慢性骨髓炎患者，金葡菌躲藏在死骨碎片里，抗菌药物或机体免疫系统很难作用到死骨碎片中的细菌，这种情况迫切需要外科手术来清除感染。

总之，SASCVs所致的慢性感染极为棘手，给微生物室和临床均带来了严峻的挑战。实验室人员要加强学习，不断提高对SCVs菌株的分离、鉴定及药敏能力；临床医师不但要对已发生的SASCVs感染采取积极的治疗（如尽快移除感染的植入装置、选择敏感抗菌药物持续治疗等），还要对潜在的感染进行有效的预防，从而减少SASCVs感染的发生。